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  • 標準解讀(一) | 《保健食品功能評價斑馬魚試驗規程》團體標準解讀!
  • 2022-5-7 16:04:03
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    標準背景

    近期,國家市場監管總局組織發布了《關于發布〈允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養素補充劑(2022年版)〉及配套文件的公告(征求意見稿)》,并公開征詢意見。該文件對于規范整個保健食品行業具有重大意義,其中配套文件之一《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版)》包括全部24種保健功能的評價方法,并由強制性方法改為推薦性方法,也積極鼓勵功能評價方法創新。

    斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物,其實驗方法既有體外實驗快速、高效的特點,又具備哺乳動物實驗相關性好、預測性高的特點。在營養保健食品的研發和評價過程中,斑馬魚實驗顯示出其獨特優勢和價值,在原料篩選、配方研發及產品功效評價等方面的應用日漸廣泛,取得了顯著的科研和產業化成果。

    杭州環特生物科技股份有限公司作為斑馬魚技術應用領域的領軍企業,成立十余年來已開發出150余種斑馬魚技術模型,申請發明專利64項(已獲授權21項),為超過600家客戶提供了6000余項實驗服務,相關技術成熟穩定,并相繼已牽頭或參與發布10項團體標準(其中3項為參與發布),有7項新藥研究成果也被成功用于CFDA的臨床試驗申報。

    斑馬魚技術,不僅可以助力企業縮短產品研發周期,降低產品研發成本,提升產品質量,從而進一步提高產品市場競爭力,促進行業繁榮發展,而且,為保健食品功能評價提供了一種快速、高效的體內評價方法,能夠幫助企業更好地適應保健食品行業消費者需求變化快、產品研發周期短的發展趨勢,讓保健食品更好地服務于民眾健康。

    2022年4月15日,由中國保健協會管理歸口,杭州環特生物科技股份有限公司牽頭,中國標準化研究院、農業農村部食物與營養發展研究所、中國疾病預防控制中心營養與健康所、中國中醫科學院中藥研究所、中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所等22家企業、科研院所共同起草的團體標準——《保健食品功能評價 斑馬魚試驗規程》(T/CHC2003-2022)正式發布并實施。

    以下就標準的重點內容進行解讀——

    主要內容及解讀

    適用范圍及解讀

    標準原文:

    本文件規定了斑馬魚用于評價保健食品功能的技術要求,術語和定義、試驗流程、受試樣品信息確認、斑馬魚準備、試驗操作、結果評價及試驗報告撰寫等內容。

    本文件適用于保健食品功能評價斑馬魚試驗。

    標準解讀:

    本文件對斑馬魚用于評價保健食品功能(包括具有保健功能的普通食品、保健食品及其原料和配方)的技術要求進行了規定,包括常用術語和定義、試驗流程、受試樣品信息確認、斑馬魚準備、試驗操作、結果評價及試驗報告撰寫等內容。

    本文件適用于普通食品及保健食品的原料篩選、配方研發及產品功能評價的斑馬魚試驗。

    重點技術內容及解讀

    1. 斑馬魚準備

    標準原文:

    1.1 按照GB/T 39649的規定執行斑馬魚質量控制。

    1.2 根據保健食品功能選擇合適的斑馬魚模型。

    1.3 選擇發育正常且狀態一致的斑馬魚進入試驗程序階段,不同年齡段斑馬魚正常發育狀態的典型圖見下圖:

    附錄A


     

     

     

    標準解讀:

    1.1 按照GB/T 39649的規定執行斑馬魚質量控制。該國標對實驗魚的種質、遺傳、微生物和寄生蟲、飼料、環境設施及其監測方法都進行了相關的規定。環特生物目前已獲得了實驗動物生產與使用許可證、AAALAC國際認證、CNAS及CMA等一系列相關資質認可。

    1.2 根據保健功能選擇合適的斑馬魚模型。不同保健功能選擇的斑馬魚模型不同,造模方式也不一樣。選擇受精后一定天數的一定品系的斑馬魚,用誘導劑處理一定的時間,建立斑馬魚保健功能評價模型。

    舉例如下:a)有助于抗氧化功能:推薦用甲萘醌處理受精后3天(3 dpf)的野生型AB品系斑馬魚24 h建立斑馬魚氧化應激模型;

    b)潤腸通便性能檢測:不需要造模;

    c)有助于維持血脂健康水平功能:推薦用高糖高脂飼料處理5 dpf的野生型AB品系斑馬魚魚48 h建立斑馬魚高糖高脂模型;

    d)有助于維持血糖健康水平功能:推薦用高糖高脂飼料處理5 dpf的野生型AB品系斑馬魚魚48 h建立斑馬魚高糖高脂模型。

    1.3 不同年齡段的斑馬魚發育狀態不同,同一實驗條件需要選擇斑馬魚選擇發育正常且狀態一致的斑馬魚進入試驗程序階段,斑馬魚的選取可參照上面的典型圖進行。

    2. 受試樣品前處理

    標準原文:

    2.1 不同性狀受試樣品的前處理方法見表1:

     

    2.2 受試樣品儲備液宜用標準稀釋水(標準稀釋水的配制見附錄B)配制,受試樣品難以用水溶解時可考慮使用低毒的助溶劑或分散劑。

    附錄B

     

    推薦的溶劑有:二甲基亞砜、乙醇、 甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。適合的分散劑有:聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化蓖麻油。

    2.3 儲備液配制完成的受試樣品應做標識,包括受試樣品名稱、受試樣品濃度、溶劑名稱、配制日期、配制人。

    標準解讀:

    受試樣品儲備液宜用標準稀釋水配制,但保健食品的成分較為復雜,很多保健食品中既含有水溶性成分,也含有脂溶性成分,還有一些不溶性成分(如超微粉碎后直接使用的原料粉、益生菌等)。為了讓保健食品中的有效成分盡量溶解或均勻分散,有時候不得不使用一些助溶劑,包括有機溶劑和分散劑。本標準推薦使用的都是相關標準中推薦或者有相關科研文獻證明其對斑馬魚安全性的助溶劑。推薦的常用有機溶劑包括:二甲基亞砜、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。推薦的分散劑有:聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化蓖麻油。

    對于助溶劑的使用限量,根據長期積累的數據以及本標準涉及到實驗內容的特點,本標準將助溶劑的濃度上限定為1%(W/V或V/V)。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%。在實驗溶液配制不受影響的情況下,助溶劑的使用量通常不應超過0.1%。只有當受試樣品溶解性確實不好且助溶劑安全性非常好的的情況下,方可將助溶劑的終濃度增加到1%。

    如果受試樣品不能溶解、乳化或制備成均勻分散的懸浮液,則不適用于本標準的方法。

    3. 暴露條件

    標準原文:

    保健食品功能評價的斑馬魚模型暴露條件如下:

    a) 持續時間:通常為4 h-72 h;

    b) 更換試驗溶液:通常暴露時間在24 h及以內不需要更換溶液。如受試樣品富含營養物質,試驗溶液容易腐敗變質,可考慮換液,換液頻率宜根據水質情況調整;

    c) 光照:暴露期間避光處理,避免光照對受試樣品穩定性的影響;

    d) 水溫:26~28.5 ℃;

    e) 溶解氧:6 mg/L飽和溶解氧;

    f) pH:6.8~7.5。

    標準解讀:

    本標準根據國內外斑馬魚相關實驗的指南和標準,規定了功能評價實驗中對斑馬魚暴露條件的要求。包括:

    a)推薦將斑馬魚幼魚的孵育水溫控制在26-28.5℃,溫度偏離這個范圍的話,斑馬魚的發育會出現明顯的延遲或加快;

    b)斑馬魚適宜的pH是在6.8-7.5之間,短期內pH5.0-9.0也可以忍受。一旦pH值<5.0或者>9.0,即便是短期內也會對斑馬魚產生嚴重傷害;

    c)溶解氧為不低于6 mg/L飽和溶解氧。24 h及以內不需要更換溶液,如受試樣品富含營養物質,試驗溶液容易腐敗變質,可考慮換液。如果換液無法解決水質惡化的問題,可以考慮加入亞甲基藍來抑制細菌增長。如果使用亞甲基藍,亞甲基藍的濃度應不大于0.1 ppm(即100 μg/L),且所有實驗組的亞甲基藍終濃度應保持一致;

    d)每次實驗前需要測試一次受試樣品溶液的溶解氧和pH,以確保受試樣品溶液的溶解氧和pH在正常的范圍內,避免水體環境對實驗結果的干擾。

    4. 確定NOEC(未觀察到效應濃度)

    標準原文:

    實時觀察并清除異常的斑馬魚,對斑馬魚的死亡和其它毒性效應進行記錄,確定受試樣品的NOEC。斑馬魚異常表現如下:

    a) 死亡判斷標準:靜止不動、無心臟跳動、軀干呈白色不透明顏色、對機械刺激無反應。

    b) 異常表型:心包水腫、靜脈瘀血、血流缺失/減少、出血、腦變性/萎縮/水腫、下頜畸形、眼畸形/水腫、肝臟變性/腫大/萎縮、卵黃囊吸收延遲、腸道發育異常、軀干彎曲/縮短/水腫、肌肉變性、鰾未充氣。異常表型的典型圖見附錄C。

    附錄C

     

     

    c) 異常行為學指標:身體側翻、游動不協調、游動劇烈和反常的靜止。

    標準解讀:

    確定NOEC的目的是為了確定受試樣品的濃度設置上限。在本標準的實驗方法中,斑馬魚是直接暴露在受試樣品溶液中,需要進行預試驗來確定受試樣品的測試濃度上限。受試樣品的濃度上限NOEC的判斷依據為:與對照相比,對試驗生物未產生顯著效應的受試樣品濃度,即受試樣品處理斑馬魚后未產生死亡、異常表型和異常行為學指標的限高濃度。

    根據經驗,對于以小分子單體化合物為主要成分的受試樣品(如維生素、礦物質),測試濃度上限定為1000 μg/mL;對于成分多樣混合物(如天然植物提取物)或分子量<3 KD的大分子化合物的測試濃度上限為2000 μg/mL;對于液體受試樣品,需要根據受試樣品中的有效成分含量或者可溶性成分濃度來確定測試上限,通常用體積比表示。對于很難溶解或很難均勻分散的受試樣品,水溶暴露后很難保證斑馬魚的有效吸收,應考慮對樣品必要的前處理或改用水溶暴露以外的其它處理方式。

    實施意義

    該標準是環特生物攜手國內22家權威科研院所、企業發布的國內頭個用于食品保健功能檢測的完整斑馬魚技術規程,不僅填補了我國食品保健功能檢測領域斑馬魚技術規程團體標準的空白,從檢測依據、斑馬魚來源和品系等信息、試驗條件和方法、試驗結果、數據處理與統計方法、推薦參數等關鍵技術內容進行了充分的實驗規范規定及技術創新,其結果適用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能評價,可操作性、先進性等關鍵指標均達到了先進水平。

    而且,該標準將進一步助力我國斑馬魚技術應用標準體系的完善,全面提升我國斑馬魚技術在保健食品行業功能評價方面的標準化及應用化水平等,對行業具有重要的指導性意義與推動性作用。

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