2022《保健食品功能評價斑馬魚試驗規程》標準解讀二

標準背景

2022年4月15日，由中國保健協會管理歸口，杭州環特生物科技股份有限公司牽頭，中國標準化研究院、農業農村部食物與營養發展研究所、中國疾病預防控制中心營養與健康所、中國中醫科學院中藥研究所、中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所等22家企業、科研院所共同起草的團體標準——《保健食品功能評價 斑馬魚試驗規程》（T/CHC2003-2022）正式發布并實施。

為了使大家更好地了解《保健食品功能評價斑馬魚試驗規程》這一團體標準重點內容，幫助更多的保健食品企業在研發中更好地應用斑馬魚技術開展斑馬魚實驗，從而適應保健食品行業消費者需求變化快、產品研發周期短的發展趨勢，環特生物推出“團體標準解讀”系列，供大家參考。第一期《標準解讀（一） | 《保健食品功能評價斑馬魚試驗規程》團體標準解讀！》（點擊可回顧）已推出。

今天，我們將為大家送上第二期，快一起來看吧↓↓

主要內容及解讀

正式試驗內容及解讀

1. 試驗分組

標準原文：

正式試驗按照以下方法挑選斑馬魚置于微孔板中進行分組：

a) 正常對照組：含斑馬魚及標準稀釋水；

b) 模型對照組：含有模型誘導劑和斑馬魚；

c) 陽性對照組：含有陽性對照樣品、模型誘導劑和斑馬魚。每次試驗設置一個陽性對照組即可；

d) 受試樣品測試組：含有受試樣品、模型誘導劑和斑馬魚。將受試樣品儲備液用標準稀釋水以幾何級數稀釋成一組適宜的濃度系列，備用。宜設置3～5個濃度組，以幾何級數濃度系列設置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數≤3.2，宜設為2；

e) 溶劑對照組：含有助溶劑、模型誘導劑和斑馬魚。當受試樣品配制過程中使用了助溶劑，應設置該組，助溶劑濃度應該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V）。

標準解讀：

正式試驗設置正常對照組、模型對照組、陽性對照組、受試樣品測試組（宜設置3～5個濃度組，以幾何級數濃度系列設置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數≤3.2，宜設為2）、溶劑對照組（當受試樣品配制過程中使用了助溶劑，應設置該組，助溶劑濃度應該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V））。

對于助溶劑的使用限量，根據長期積累的數據以及本標準涉及到實驗內容的特點，本標準將助溶劑的濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%。在實驗溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應超過0.1%。只有當受試樣品溶解性確實不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度最高增加到1%。

2. 造模

標準原文：

選擇受精后一定天數的斑馬魚，用誘導劑處理一段時間，建立斑馬魚保健食品功能評價模型。根據保健食品功能選擇合適的斑馬魚模型。

標準解讀：

不同保健食品功能選擇的斑馬魚模型不同，造模方式也不一樣。選擇受精后一定天數的一定品系的斑馬魚，用誘導劑處理一定的時間，建立斑馬魚保健食品功能評價模型。根據保健食品功能選擇合適的斑馬魚模型，不同斑馬魚模型的建立方法。

3. 受試樣品處理

標準原文：

根據試驗需求，預先篩選好足夠數量且發育正常的斑馬魚胚胎，并隨機分配到試驗容器中，每孔斑馬魚數量至少為10尾。用模型誘導劑建立斑馬魚模型，然后向試驗容器中加入一定體積的受試樣品溶液（飼養密度宜為1尾/100μL）、陽性對照樣品。充分混勻后，用鋁箔紙包裹，在28℃生化培養箱中避光孵育至終點。

4. 死亡與毒性判斷

標準原文：

當所有試驗組斑馬魚死亡率≤10%時，準許進入數據采集階段。

5. 數據采集

標準原文：

應根據不同斑馬魚保健食品功能評價模型的具體評價指標選擇合適的數據采集方式，數據采集具體方式如下：

a) 直接拍照：孵育結束后，從表型正常的斑馬魚中隨機選取至少10尾斑馬魚，用三卡因麻醉后，將斑馬魚用3%甲基纖維素固定（甲基纖維素應提前在室溫放置至少30分鐘），在體視顯微鏡或熒光顯微鏡（轉基因熒光斑馬魚品系相關的試驗）下觀察、拍照并保存。所有試驗組斑馬魚拍照應在相同的儀器和環境條件下完成，且斑馬魚體位保持一致。利用圖像處理軟件測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強度（熒光顯微鏡），每組的有效數據量不低于10個。

b) 染色后拍照：孵育結束后，試驗容器中的斑馬魚用養殖水清洗3次，采用特異性熒光染料或組織化學染料對各組斑馬魚進行染色。染色后各組至少取10 尾斑馬魚，用3%甲基纖維素固定。特異性熒光染料染色的斑馬魚用熒光顯微鏡觀察、拍照并保存，組織化學染料染色的斑馬魚用體視顯微鏡觀察、拍照并保存。利用圖像處理軟件對圖像進行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強度（熒光顯微鏡），每組的有效數據量不低于10個。

c) 運動行為分析：孵育結束后，試驗容器中的斑馬魚用養殖水清洗3次，每個試驗組隨機選擇斑馬魚轉移至96孔板中，每孔1尾，利用行為分析儀記錄斑馬魚的運動軌跡，記錄時間宜為20 min～1 h，每組的有效數據量不低于10個。

d)酶標儀檢測：孵育結束后，試驗容器中的斑馬魚用養殖水清洗3次，每個試驗組隨機選擇斑馬魚轉移至96孔板中，每孔1～3尾，按照試劑盒檢測說明書進行試驗操作，利用酶標儀測定OD值、熒光值或生物光值。選擇符合檢測試劑要求的激發波長和發射波長，檢測時間宜為20 min～1 h，每組的有效數據量不低于3個。

標準解讀：

應根據不同斑馬魚功能評價模型的具體評價指標選擇合適的數據采集方式，數據采集具體方式如下：

a）直接拍照：斑馬魚的膽囊在斑馬魚軀干偏右側，當斑馬魚側躺時，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會對拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點瓊脂糖或甲基纖維素等對斑馬魚進行固定。斑馬魚從開始麻醉到拍照結束的時間不宜超過30分鐘，超過30分鐘可能會對斑馬魚造成損傷或導致死亡。利用圖像處理軟件對圖像進行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強度（熒光顯微鏡），為了保證后續統計分析結果的有效性，每組的有效數據量不低于10個。

b）染色后拍照：拍照時一般要求斑馬魚應頭朝左、腹部朝下、完全側躺，所有斑馬魚的體位保持一致。斑馬魚的膽囊在斑馬魚軀干偏右側，當斑馬魚側躺時，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會對拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點瓊脂糖或甲基纖維素等對斑馬魚進行固定。熒光顯微鏡拍照時，相機的相關參數設置應既能保證拍到熒光信號、又能最大程度減少背景噪點，盡量減少背景干擾。整個熒光顯微鏡拍照過程中要盡量減少可見光照射或照射強度，以免熒光試劑猝滅過快，干擾實驗結果。斑馬魚從開始麻醉到拍照結束的時間不宜超過30分鐘，超過30分鐘可能會對斑馬魚造成損傷或導致死亡。利用圖像處理軟件對圖像進行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強度（熒光顯微鏡），為了保證后續統計分析結果的有效性，每組的有效數據量不低于10個。

c）運動行為分析：正式記錄前，根據實驗需求可進行預跑10 min，以檢測及維持儀器穩定并可使斑馬魚更好的適應環境，記錄時間宜為20 min-1 h，為了保證后續統計分析結果的有效性，每組的有效數據量不低于10個。

結果評價及解讀

1. 統計分析

標準原文：

1.1 利用統計分析軟件進行相關圖表制作與統計學分析。計算各組試驗的平均值（Mean）及標準誤差（Standard Error，SE），統計學處理結果用Mean ± SE表示。宜采用方差分析，按方差分析的程序先進行正態性檢驗（P值）和方差齊性檢驗（F值）。

1.2 當F<0.05，P<0.05時，各組均數間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數檢驗。

1.3 當F≥0.05，P≥0.05時，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結果進行統計。

1.4 對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計。若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

2. 結果有效性分析

標準原文：

2.1 正常對照組（當使用了助溶劑，也包括溶劑對照組）斑馬魚的死亡率或異常率不得超過10%，超過10%則該次試驗結果視為無效。

2.2 模型對照組與正常對照組之間的原始數據存在統計學上的顯著性差異，陽性對照組與模型對照組之間的原始數據存在統計學上的顯著性差異，否則該次試驗結果視為無效。

2.3 當使用了助溶劑，溶劑對照組與正常對照組之間的原始數據不能存在統計學上的顯著性差異，否則該次試驗結果視為無效。

標準解讀：

根據前期積累的大量實驗數據以及本次用已上市保健食品和在研保健食品開展的驗證實驗結果，當且僅當一個實驗滿足如下的質量控制要求時，實驗結果的有效性才會被認可。只準許有效試驗結果進入試驗報告撰寫/審核階段。

實驗報告撰寫及解讀

標準原文：

試驗報告應包括以下內容：

a) 檢測依據；

b) 受試樣品和陽性對照的信息，包括與試驗操作相關的理化性狀；

c) 斑馬魚來源和品系等相關信息；

d) 試驗條件和方法，包括試驗具體步驟；

e) 試驗開始至完成的日期；

f) 試驗結果，包括測定數據、計算值、圖像數據等；

g) 數據處理與統計方法；

h) 結論。

標準解讀：

試驗報告應包括：檢測依據、受試樣品和陽性對照的信息、斑馬魚來源和品系等相關信息、試驗條件和方法、試驗開始至完成的日期、試驗結果、數據處理與統計方法、結論。

實施意義

該標準是環特生物攜手國內22家權威科研院所、企業發布的國內首個用于食品保健功能檢測的完整斑馬魚技術規程，不僅填補了我國食品保健功能檢測領域斑馬魚技術規程團體標準的空白，從檢測依據、斑馬魚來源和品系等信息、試驗條件和方法、試驗結果、數據處理與統計方法、推薦參數等關鍵技術內容進行了充分的實驗規范規定及技術創新，其結果適用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能評價，可操作性、引領性、先進性等關鍵指標均達到了先進水平。

而且，該標準將進一步助力我國斑馬魚技術應用標準體系的完善，全面提升我國斑馬魚技術在保健食品行業功能評價方面的標準化及應用化水平等，對行業具有重要的指導性意義與推動性作用。