2022年1月25日，《自然》雜志發布一篇專欄文章《Seven technologies to watch in 2022》，基于基因編輯技術的診斷、完整版基因組、蛋白質結構解析、量子模擬、精確基因組調控、靶向基因療法、空間多組學等獲評“有望改變2022年科學進程的7大前沿技術”。

近年來，斑馬魚基因編輯技術在基因敲除、基因敲入、轉基因訂制及表觀遺傳修飾等方面的應用日益廣泛，為基因組研究、研發新的癌癥治療方法、攻克遺傳性疾病等提供了全新的研究切入點及應用方向，也讓我們見證著生物學上的突破對人類生命質量提高的巨大影響力。

環特生物，依托10余年的斑馬魚基因編輯經驗，深度挖掘、創新斑馬魚技術的應用場景，已為150多家單位提供斑馬魚基因敲入、敲除、敲降、定制轉基因技術服務及斑馬魚疾病模型開發等專業的基因編輯技術服務，累計完成350例以上基因編輯品系，測試超過1000個gRNA靶點，推動了諸多前沿基因功能研究取得了突破性進展，為斑馬魚基因編輯技術在更加廣泛的研究領域內的創新性應用奠定了堅實的技術基礎。

本期我們繼續為大家分享斑馬魚基因編輯服務案例之二——

● 服務案例6.H2S通過斑馬魚的NOS/NO途徑促進發育性腦血管生成

研究背景：硫化氫（H2S）與一氧化氮（NO）和一氧化碳一起被認為是氣體遞質家族的第三個成員。據報道，H2 S通過促進內皮細胞的生長、遷移和管狀結構的形成來誘導血管生成。這些研究是在細胞培養、小鼠基質凝膠栓試驗模型、大鼠傷口愈合模型或大鼠后肢缺血模型的條件下進行的。新近的體內研究表明H2S在肌肉血管生成中的生理重要性。然而，內源性H2S在發育過程中對腦血管生成的重要性尚不清楚。因此，我們旨在確定H2S在腦血管發育中的作用。

研究目的：確定H2S在腦血管發育中的作用。

研究方法：使用嗎啡啉和Cas9介導的基因編輯，敲除cbs和cth,損害斑馬魚幼魚的腦血管發育。緩慢釋放的H2S供體GY4137孵育可緩解cbs和cth變形劑的腦血管發育缺陷。對中腦血管網絡的定量分析表明，H2S在不影響腦血管系統拓撲結構的情況下促進血管生成。機械上，cbs和cth變形劑中的一氧化氮合酶2a（nos2a）表達和NO生成均降低。通過將cbs或cth-MO與全長斑馬魚nos2a mRNA共注射，nos2a的過度表達減輕了cbs和cth變體的腦血管發育缺陷。

研究結論：H2S通過斑馬魚體內NOS/NO途徑促進腦發育血管生成。

研究成果出處：Jiang, Weiqing et al. H2S promotes developmental brain angiogenesis via the NOS/NO pathway in zebrafish. 2021

● 服務案例7.非典型蛋白酶激活受體1（part1）調節斑馬魚的淋巴分化

研究背景：PAR家族，尤其是part1，是血管止血、血栓形成和炎癥的關鍵介質

研究目的：探索par1在斑馬魚胚胎淋巴分化調控中的作用。

研究方法：

（1）制備斑馬魚par1和gnai2a突變體；

（2）將par1突變體與Tg(lyve1b:dsRed;flk1:EGFP)系雜交標記靜脈血管和淋巴管出芽；

（3）通過WISH分析gnai2同源基因(gnai2a和gnai2b)在斑馬魚胚胎中的表達模式；

（4）在Tg(fli1a:EGFP)胚胎中使用抗prox1抗體進行54hpf的免疫染色實驗

研究結論：mmp13b-par1-gnai2a軸通過促進Vegfc/Flt4/Erk1/2信號通路調控斑馬魚淋巴管生成過程。

研究成果出處：Daoxi Lei,Xiuru Zhang,Muhammad Abdul Rouf,Yoga Mahendra,Lin Wen,Yan Li,Xiaojuan ZhangLi Li,Luming Wang,Tao Zhang,Guixue Wang,Yeqi Wang,Noncanonical protease-activated receptor 1 regulates lymphatic differentiation in zebrafish, 2021

● 服務案例8. klf6a-tagln2軸通過調節內皮細胞重排和肌動蛋白細胞骨架動力學來驅動斑馬魚血管修剪

研究背景：血管重構是血管生理和病理的關鍵。由血管生成形成的原始血管叢，隨后經過廣泛的血管重構，建立起具有功能和層次的分支血管網絡。

研究目的：進一步了解大直徑血管的修剪。

研究方法：

（1）利用基因編輯技術制備klf6a/tagln2 mut和KI品系；

（2）三卡因0.06 mg/ mL處理至72 hpf；

（3）斑馬魚胚胎的延時實時成像；

（4）計算紅細胞流動速度

研究結論：發現斑馬魚胚胎尾靜脈叢的腹側毛細血管被修剪成大直徑的尾靜脈血管，klf6a-tagln2軸通過促進內皮細胞重排列和連接重構來調控血管修剪。

研究成果出處：Lin Wen, Tao Zhang, Jinxuan Wang, Xuepu Jin, Muhammad Abdul Rouf, Desha Luo, Yuan Zhu, Daoxi Lei, Hans Gregersen, Yeqi Wang, Guixue Wang. The blood flow-klf6a-tagln2 axis drives vessel pruning in zebrafish by regulating endothelial cell rearrangement and actin cytoskeleton dynamics，2021

● 服務案例9.BDE-99通過轉錄因子six7破壞斑馬魚幼蟲的光感受器模式

研究背景：多溴聯苯醚 (PBDEs)在水，室內空氣，和日常食物中均可檢測到，其暴露與糖尿病肥胖和神經發育缺陷等代謝性疾病密切相關。BDE-99是商用多溴聯苯醚(PBDEs)主要成分(占42-48%)。視覺障礙是一種標志性的新興毒理學效應，多溴聯苯醚(PBDEs)會損害斑馬魚的視力發育，甲狀腺激素(TH)信號傳導被懷疑是主要貢獻者，six7在硬骨魚的MW 錐體分化中發揮了重要作用，而外源性T3處理可以顯著抑制six7的表達。這表明其與TH之間的潛在關系。

研究目的：通過對six7在感光器圖案化過程中的調節作用，研究PBDEs 視覺毒性的機制。

研究方法：在BDE-99濃度量化后，進行斑馬魚的視覺引導的行為測試。通過RNA 提取和、qRT-PCR 分析、冷凍切片和 H&E 染色以及斑馬魚中 six7 表達的敲除和過表達來進行研究。

研究結論：

（1）BDE-99 會損害視網膜中的多個光感受器，并在受精后 120 小時干擾斑馬魚幼魚色覺引導的行為；

（2）光感受器的損傷無法通過引入TH受體拮抗劑來完全恢復改變，這表明其他潛在調節因素的參與；

（3）通過調節中波長視蛋白的關鍵誘導劑 six7 的表達，我們證明了在 BDE-99 的破壞中，是 six7 而不是 THs主導了感光器圖案化。該工作促進了對 six7 在感光器圖案化過程中的調節作用的理解，并提出了 PBDEs視覺毒性的新機制。

研究成果出處：Wei S, Chen F, Xu T. BDE-99 Disrupts the Photoreceptor Patterning of Zebrafish Larvae via Transcription Factor six7 . 2022