斑馬魚CRISPR基因編輯技術服務，含基因敲入品系制備、基因敲入品系制備、轉基因品系制備等。

斑馬魚基因敲入品系制備

服務簡介：

1. 基因敲入(Knock in)

非同源依賴的DNA修復技術，在斑馬魚基因組定點插入外源DNA片段（熒光蛋白、PA等）。

2. 基因敲入技術特點

    2.1 定點插入；

    2.2敲入效率較低。

服務流程：

根據客戶基因敲入要求進行基因分析；

cas9 mRNA和多個gRNA靶點的設計及合成；

高效gRNA靶點的篩選及效率驗證；

敲入載體設計及構建；

斑馬魚胚胎的顯微注射和敲入驗證；

F0代斑馬魚的可遺傳性篩選；

雜合子F1代斑馬魚的基因型鑒定。

環特生物優勢：

國際一流的斑馬魚敲入技術以及上百例的成功經驗；

特有的高效篩選方法。

案例展示：

斑馬魚基因敲除品系制備

服務簡介

1.基因敲除(Gene Knockout)

根據給定GeneID或Gene name，分析基因保守結構域，在保守結構域或客戶指定區域設計靶點并制備靶點gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因產生移碼突變，通過PCR篩選得到穩定遺傳品系。

2. 基因敲除技術特點

    2.1 通過將基因敲除斑馬魚品系與野生型相比較，研究者可以揭示特定基因的功能。

    2.2 在基因組水平上將目標基因敲除，遺傳背景干凈清晰，是研究基因功能的金標準。

服務流程

▲根據客戶提供的GeneID或Gene name進行基因分析——▲cas9 mRNA和多個gRNA靶點的設計及合成——▲高效gRNA靶點的篩選及效率驗證——▲F0代斑馬魚的可遺傳性篩選——▲雜合子F1代斑馬魚的基因型鑒定

環特生物優勢

成熟的基因敲除技術快速獲得穩定品系；

多靶點共注射F0代驗證基因功能。

斑馬魚敲除品系成功案例

1、基因分析

分析目的基因的保守結構域；

2、靶點篩選

設計4個gRNA靶點，PCR檢測包含靶點的區域真實序列，顯微注射驗證靶點效率；

3、大規模注射養殖F0

Cas9 pro+gRNA 共注射，共養殖 F0 約 80 條用于后期Founder篩選；

4、Founder 篩選 

F0代斑馬魚與野生型外交，收集48hpf的F1胚胎抽取基因組，PCR鑒定，測序結果在靶點位置出現雙峰的認為產生突變，然后TA clone驗證其可能產生的突變方式；

5、F1 代篩選

F1代斑馬魚剪尾篩選，TA clone驗證突變方式：

通過對測序圖譜的分析獲得突變方式為：-5bp，產生移碼突變的敲除斑馬魚；

通過對測序圖譜的分析獲得突變方式為：-4-3bp，產生移碼突變的敲除斑馬魚模型。

斑馬魚轉基因品系制備

服務簡介

1. 轉基因

斑馬魚轉基因技術包括顯微注射、電穿孔技術（電脈沖介導）、精子載體法、GAL4/UAS 轉錄激活系統、Tol2轉座子介導、擬型反轉錄病毒介導、重組桿狀病毒介導等方法。

2. 轉基因技術目的

    2.1 通過定點敲除技術進行基因鑒定和功能研究； 

    2.2 利用報告基因對受體等蛋白質進行功能研究；

    2.3 構建各種斑馬魚突變體，通過斑馬魚疾病模型進行人類疾病研究和藥物篩選；

    2.4 構建含有特異性啟動子的生物感應器，用于環境監測。

3. Tol2轉座子介導的轉基因技術優點

    3.1 Tol2轉座子可攜帶大片段DNA；

    3.2 Tol2轉座子沒有位置偏好性，幾乎能整合到染色體的任意位置；

    3.3 Tol2轉座子的耐受范圍很廣；

    3.4 Tol2作為天然的具有自主轉座活性的脊椎動物轉座子，能夠在胚胎發育的不同時期進行有效的轉移；

    3.5 Tol2轉座子介導的轉基因技術能夠有效克服外源基因在后代傳遞頻率低的技術難題。

服務流程

▲客戶提出轉基因品系制備需求→▲分析可行性→▲構建載體→▲斑馬魚胚胎注射→▲founder篩選→▲F1代斑馬魚養殖→▲F2代斑馬魚養殖

環特生物優勢

1.特有的養殖方法可縮短服務周期；

2.豐富的經驗和及時溝通助力科研實驗。

參考文獻：

[1] 劉麗麗, 王健, 王海勝,等. 斑馬魚轉基因平臺的建立[J]. 生物技術通報, 2013(010):120-126.

[2] 陶然, 常玉梅, 李世國,等. Tol2轉座子的特性及其在轉基因魚類中的應用[J]. 水產學雜志, 2014, 000(001):60-64.